São constituídas por diferentes aminoácidos ligados através de ligações peptídicas?

Estrutura básica das proteínas

As proteínas são as macromoléculas mais abundantes nos seres vivos, constituindo cerca de 50% do peso vivo (em base seca). São também as biomoléculas mais versáteis quanto a funcionalidade, e essa versatilidade funcional está determinada pelo número, a classe e a sequência dos aminoácidos que compõem suas unidades estruturais. Todas as células do organismo possuem proteínas, e elas representam a expressão da informação genética contida no DNA. A palavra “proteína” provem do grego protos (primeiro, primazia), indicando que eram consideradas como o início ou a base de todas as biomoléculas.

Os aminoácidos como unidades básicas das proteínas

Todas as proteínas estão constituídas a partir dos mesmos 20 tipos de aminoácidos, unidos por ligações peptídicas, variando nas diferentes proteínas tão somente o número e a sequência dos aminoácidos. Os aminoácidos são moléculas pequenas, com peso molecular médio de 130; todos têm em comum a presença de um grupo carboxila e de um grupo amina unidos ao mesmo carbono (carbono a) e diferem entre si na estrutura do seu grupo residual (grupo R):

Além dos 20 aminoácidos que fazem parte das proteínas, existem outros que têm funções metabólicas diversas (por exemplo, ornitina e citrulina, metabólitos intermediários do ciclo da ureia). Todos os aminoácidos têm pelo menos um carbono assimétrico, o carbono alfa, formando, portanto, um centro quiral. A exceção é a glicina, na qual o grupo R é um H, tendo, portanto, 2 hidrogênios em seu carbono alfa. Assim, os aminoácidos possuem estereoisômeros, podendo desviar o plano da luz polarizada. Desta forma existem aminoácidos dextro e levo-rotatórios. Por outro lado, ao serem isômeros, sua configuração relativa pode ser D ou L, a qual está referida com relação a posição do grupo NH2 no carbono alfa. O aminoácido de referência é a alanina:

A alanina existente nos animais superiores é um estereoisômero tipo L pois o grupo alfa‑amina (NH2) está orientado para a esquerda, da mesma forma que todos os demais aminoácidos que formam parte das proteínas. Existem, raramente (em bactérias), alguns aminoácidos D, mas estes não formam parte das proteínas.

Aminoácidos componentes das proteínas

Os aminoácidos estão classificados em 5 grupos, em função da estrutura de seus grupos residuais (grupos R), de acordo com a polaridade e a carga:

(1) Aminoácidos não polares (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro): seus grupos R são alifáticos e hidrofóbicos; a glicina é o aminoácido mais simples (grupo R –> H); a prolina é, na verdade, um iminoácido (grupo amina secundário) pois o carbono a está unido com o extremo do grupo R, ciclizando a molécula e deixando-a mais rígida

(2) Aminoácidos polares, porém sem carga (Ser, Thr, Cys, Met, Asn, Gln): são hidrofílicos e sua polaridade pode ser dada pelos grupos hidroxila, amida ou sulfidrila (tiol) que formam pontes de H com a água; asparagina e glutamina são amidas dos ácidos aspártico e glutâmico, respectivamente; a cisteína pode sofrer oxidação em seu grupo sulfidrila (SH) e formar um composto dimérico (Cys-Cys ou cistina) por união de duas cisteínas mediante uma ponte dissulfeto (S-S); essas pontes são comuns nas proteínas e contribuem para estabilizar a molécula

(3) Aminoácidos com carga negativa ou aminoácidos ácidos (Asp, Glu): a carga está determinada pelos grupos carboxila ionizados

(4) Aminoácidos com carga positiva ou aminoácidos básicos (Lys, Arg, His): a carga positiva está determinada pelos grupos amina (Lys), guanidino (Arg) ou imidazol (His)

(5) Aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp): são relativamente não polares; tirosina e triptofano têm maior polaridade que a fenilalanina; os anéis aromáticos destes aminoácidos absorvem a luz ultravioleta a 280 nm, constituindo-se na base para a análise de proteínas usando espectrofotometria UV; a intensidade de absorção de luz UV é Trp > Tyr > Phe.

O organismo dos mamíferos não pode sintetizar todos os aminoácidos que formam parte das proteínas. Dez dos 20 aminoácidos proteicos são aminoácidos essenciais, isto é, devem ser incorporados na dieta dos mamíferos. Sem estes aminoácidos o organismo não pode sintetizar as proteínas de reposição e as requeridas nos processos de crescimento ou aqueles que exigem síntese proteica (gestação, lactação, etc.). A arginina pode ser considerada como um aminoácido não essencial nos adultos. Porém, durante o crescimento, quantidades adequadas deste aminoácido não são sintetizadas, tornando-o essencial em animais jovens. Os requerimentos da metionina aumentam se a dieta não incorpora cisteína, aminoácido que é sintetizado a partir da metionina. Efeito similar acontece com a fenilalanina, cujos requerimentos aumentam quando não é fornecida tirosina na dieta. A glicina é aminoácido essencial nas aves.

Aminoácidos essenciais e não essenciais nos mamíferos

Propriedades químicas dos aminoácidos

Os aminoácidos podem estar ionizados em soluções aquosas, em pelo menos dois grupos ionizáveis: o grupo ácido e o grupo amina do carbono alfa:

Por ter duas cargas elétricas opostas, a forma completamente ionizada chama-se íon dipolar ou zwitteríon (íon híbrido). Esta característica influi para aumentar o ponto de fusão dos aminoácidos livres, pois as cargas fazem mais estáveis e unidas as moléculas entre si. Os alfa‑aminoácidos em forma dipolar podem atuar como ácidos ao cederem prótons e como bases ao aceitarem prótons, tendo portanto dupla propriedade, pelo qual são chamados de compostos anfóteros, isto é, que atuam como ácido o como base. O aminoácido em forma de zwitteríon que cede o H do grupo amina atuaria como ácido:

Por outro lado, atuaria como base o aminoácido zwitteríon que aceita um H+ no seu grupo carboxila ionizado:

A forma completamente protonada dos aminoácidos pode ceder 2 íons H+ e, portanto, comportar-se como ácido diprótico:  

As três possíveis formas de protonação anteriores fazem com que os aminoácidos tenham uma curva de titulação típica dos seus dois grupos ionizáveis. Nesta curva, há duas “planícies”, correspondentes às zonas com maior capacidade tamponante. No primeiro estágio, titulação do grupo carboxila, este grupo, num pH = 1, encontra-se completamente protonado (com carga positiva). Na medida em que se adiciona OH– (base para neutralizar o ácido) ao sistema, começa a ocorrer perda de prótons (ionização) do grupo carboxila, o qual é o primeiro a dissociar-se, até chegar ao ponto médio da titulação (pK1), isto é, quando existem quantidades equimolares das formas dadora e receptora de prótons do grupo carboxila:

Na curva de titulação da alanina, este ponto é atingido quando o pH = 2,34, o que significa que o pK do grupo carboxila (pK1) da alanina é de 2,34. É possível continuar com a titulação do grupo carboxila até atingir o ponto de completa ionização. No caso da alanina esse ponto atinge-se no pH = 6,02. Neste ponto a forma do aminoácido é dipolar isoelétrica, e este valor de pH conhece-se como o ponto isoelétrico. No segundo estágio da titulação começa a ocorrer perda de prótons do grupo amina (titulação do grupo NH3+): ao chegar ao ponto médio da titulação (pK2) haverá quantidades equimolares das formas dadora e receptora de prótons do grupo amina:

Este ponto é atingido na alanina no pH = 9,69, definindo, consequentemente, o pK2 do grupo amina da alanina como sendo 9,69. A titulação é finalizada próximo de pH = 12, onde a forma predominante do aminoácido está completamente desprotonada (com carga negativa). O pK1 (pK do grupo carboxila) da alanina é bastante baixo (2,34) comparado, por exemplo, com o pK do ácido acético (4,76), significando que o grupo carboxila dos aminoácidos tem mais força de dissociação do que os ácidos orgânicos, portanto são ácidos mais fortes. Isto se deve à repulsão eletrostática entre o grupo carboxila (COO–) e o grupo amina (NH3+). Mediante a equação de Henderson‑Hasselbalch é possível calcular a proporção das formas receptor/dador de prótons num determinado pH. O pH do meio determina o estado de protonação dos grupos amina e carboxila dos aminoácidos e, portanto, determina sua carga elétrica. Esta característica é importante para os métodos de análise dos aminoácidos, pois cada aminoácido tem diferentes pK para seus grupos amina e carboxila e para aqueles grupos susceptíveis de serem ionizados existentes nos seus resíduos.

Valores de pK dos grupos ionizáveis de alguns aminoácidos a 25°C

Devido a que a maior capacidade tamponante de um aminoácido está próxima do pK de qualquer um de seus grupos ionizáveis, pode-se observar que somente a histidina possui um pK perto do pH intracelular (pKR = 6,0), constituindo o único aminoácido isolado com capacidade tamponante no organismo. Entretanto, os grupos dissociáveis dos resíduos dos aminoácidos proteicos (quando se encontram associados dentro das proteínas) variam seu pKR de forma a permitir-lhes certa capacidade tamponante. A proteína hemoglobina, presente nos eritrócitos, é rica em resíduos de histidina, e tem uma importante ação amortecedora do pH no sangue.

Dedução do ponto isoelétrico (pI) dos aminoácidos

O ponto isoelétrico (pI) nos aminoácidos monoamino-monocarboxílicos calcula-se pela seguinte fórmula:

Esta fórmula pode ser deduzida, visualizando todas as possíveis formas de protonação dos aminoácidos, desde a mais protonada até a menos protonada:

As duas equações anteriores têm suas respectivas constantes de equilíbrio:

No ponto isoelétrico as formas catiônica e aniônica são equimolares. Portanto:

[R-CH(NH3+)COOH] =  [R-CH(NH2)COO–]

Resolvendo a forma catiônica em k1:

Resolvendo a forma aniônica em k2:

Igualando os valores das formas aniônica e catiônica:

Eliminando os dois termos iguais nos numeradores:

Multiplicando por (-log) ambos os termos da equação:

Aminogramas

Os métodos de análise para aminoácidos exploram a característica de ter carga elétrica em função do pH do meio. Assim, um dos métodos mais usados, a cromatografia de troca iônica, usa resinas de troca catiônica, isto é, grupos com carga negativa (como o sulfonato: SO3–, que compõem a fase estacionária da coluna cromatográfica) os quais atraem íons positivos (cátions). Se a solução com a mistura de aminoácidos a ser analisada está em um pH ácido (por exemplo, pH = 3) então a maioria dos aminoácidos estarão protonados (com carga positiva) embora com cargas elétricas de diferente valor entre os diferentes aminoácidos. A interação entre os aminoácidos e a resina de troca catiônica será específica para cada um, sendo mais forte entre os aminoácidos básicos (com maior carga positiva) do que entre os aminoácidos ácidos (com maior carga negativa). O tampão usado para eluir os aminoácidos (fase móvel) pode modificar seu pH, por exemplo aumentando e, portanto, modificando a carga elétrica dos aminoácidos que estão interatuando com a resina, para assim terminar de eluir todos os aminoácidos. O anterior é o princípio do analisador automático de aminoácidos, o qual usa geralmente três tipos de tampão (fase móvel) em sequência de pH 3,25; 4,25 e 5,28. A ordem de eluição dos aminoácidos é: Asp, Thr, Ser, Glu, Pro, Gly, Ala, Cys, Val, Met, Ile, Leu, Tyr, Phe, Lys, His, Arg. Os aminoácidos eluidos são posteriormente analisados mediante fotometria ao reagirem com a ninidrina, composto que gera um complexo de cor roxa que é lido a 570 nm e cuja intensidade de cor é proporcional à concentração do aminoácido.

Peptídeos e proteínas

Os aminoácidos podem unir-se entre si de forma covalente através de ligações peptídicas, nas quais o grupo alfa‑carboxila de um aminoácido se condensa com o grupo alfa‑amina de outro aminoácido, com a saída de uma molécula de água. A união peptídica é rígida e não pode rotar devido a que a união C-N tem um caráter parcialmente duplo, fazendo ressonância com a união C=O. Esta limitação para rotar diminui o número de possíveis conformações que as proteínas possam tomar. Existe um pequeno dipolo na união peptídica devido às cargas parciais sobre os átomos de oxigênio (-) e de nitrogênio (+) o que permite a formação de pontes de H entre diferentes ligações peptídicas, isto é, entre o H unido ao N de uma união com o O unido ao C de outra união:

N-H ||| O-C

Os peptídeos têm comprimento variado em função do número de aminoácidos que os conformam: podem ser dipeptídeos (2 aminoácidos), tripeptídeos (3 aminoácidos), tetrapeptídeos (4 aminoácidos), etc. até oligopeptídeos (10-20 aminoácidos) ou polipeptídeos, os quais têm pesos moleculares de até 10.000 (por volta de 90 aminoácidos). Polipeptídeos maiores com função conhecida podem considerar-se proteínas.

Por convenção, a leitura da sequência dos aminoácidos de um peptídeo é feita da esquerda (extremo amina) à direita (extremo carboxila). Existem alguns peptídeos pequenos com atividade biológica, principalmente tendo funções de hormônios ou de transmissores nervosos (como a oxitocina ou as endorfinas). Alguns hormônios peptídicos de baixo peso molecular incluem a insulina (e.g., a insulina bovina tem um peso molecular de 5.700 com duas cadeias de 30 e 21 resíduos de aminoácidos), o glucagon (29 resíduos), o ACTH (39 resíduos), o GnRH (10 resíduos), a oxitocina (9 resíduos) e o TRH (com 3 resíduos de aminoácidos é o menor hormônio peptídico).

Funções das proteínas

As proteínas constituem as moléculas mais abundantes nas células e também as mais versáteis, pois têm múltiplas funções, entre as quais estão as seguintes:

1) Estrutura: muitas proteínas servem de suporte estrutural ou protetor em diversos organismos: colágeno em tendões, cartilagens e tecido conectivo, elastina em ligamentos, queratina em chifres, cascos, pelo, penas, unhas e carapaças, fibroína na seda e nas teias de aranha e resilina nas asas dos insetos.

2) Hormônios: grande número de hormônios ou sinais regulatórias do metabolismo são proteínas ou peptídeos. Os órgãos endócrinos que produzem hormônios proteicos incluem: hipotálamo (peptídeos), hipófise (LH, FSH, GH, TSH, prolactina), pâncreas (insulina, glucagon), paratireoide (PTH), trato gastrointestinal (secretina, GIP, VIP, gastrina) e placenta (lactógeno placentário, eCG, hCG). Existem também proteínas que regulam a ação hormonal dentro das células-alvo, como as proteínas G, chamadas assim porque se unem ao GTP.

3) Enzimas: estes compostos exemplificam a grande diversidade que existe nas proteínas, já que são catalisadores biológicos altamente específicos para cada substrato. Atualmente existem mais de 2.000 enzimas classificadas.

4) Transporte: as proteínas no sangue são o veículo de transporte de muitos nutrientes: as lipoproteínas transportam triglicerídeos, fosfolipídios e colesterol, a hemoglobina transporta O2 dentro dos eritrócitos, a transferrina transporta ferro, a ceruloplasmina transporta cobre, a albumina transporta ácidos graxos; muitas globulinas são transportadoras de hormônios (SHBG de esteroides sexuais, TBG de hormônios tireoidianos).

5) Receptores: muitos hormônios atuam através de receptores proteicos localizados nas membranas plasmáticas, no citosol ou no núcleo das células-alvo.

6) Defesa: as imunoglobulinas ou anticorpos são proteínas especializadas em defender o organismo de elementos estranhos. São produzidas pelos linfócitos T mediante um complexo mecanismo ainda não completamente esclarecido. O fibrinogênio e a trombina são proteínas de defesa que atuam na coagulação sanguínea.

7) Contração: actina e miosina são as proteínas que, ao mesmo tempo que fazem parte da estrutura do músculo, têm a propriedade de produzir contração. A tubulina e a dineína são também proteínas contrateis que atuam em cílios e flagelos, e também na cauda dos espermatozoides para permitir a sua locomoção.

8) Reserva de nutrientes:  a albumina é uma proteína do sangue que serve como armazenadora de aminoácidos, a ovoalbumina é a proteína de reserva de nutrientes no ovo e a caseína faz o próprio no leite, a ferritina é uma proteína que armazena ferro.

As proteínas estão constituídas pelos mesmos 20 tipos de aminoácidos em todos os casos e sua diferença estrutural e funcional está determinada pelo número e a sequência dos aminoácidos, isto é, pela estrutura primária. A sequência dos aminoácidos pode estar em qualquer ordem e pode haver repetição de aminoácidos dentro da mesma proteína, não existindo limite no número de aminoácidos participantes. Assim, por exemplo, um polipeptídeo pequeno que contiver 20 aminoácidos poderia teoricamente chegar a ter um número 20 fatorial (20! = 20x19x18x17x16x…x1 = 2×1018) de diferentes combinações de possíveis sequências. Isto com somente 20 aminoácidos, mas normalmente as proteínas possuem mais de 20 aminoácidos, o que ilustra a grande variedade de proteínas virtualmente possíveis. Entretanto, de todas essas formas possíveis, muito poucas resultam em proteínas com uma função específica. É como imaginar todas as possíveis combinações que as letras do alfabeto podem dar, mas somente umas poucas dessas combinações resultam em palavras com significado.

O tamanho das proteínas é muito variado: desde a insulina (com 51 resíduos de aminoácidos e peso molecular 5.733 d) até a enzima glutamato desidrogenase (com 8.300 resíduos e peso molecular de 1 milhão d). Todavia, a grande maioria das proteínas têm menos de 2.000 resíduos de aminoácidos (peso molecular< 220.000 d). Para calcular o número aproximado de aminoácidos de uma proteína divide-se o peso molecular da proteína por 110, devido a que o peso molecular médio dos aminoácidos que conformam as proteínas é de 128 e a que se perde uma molécula de água (peso molecular 18) em cada união peptídica.

Classificação das proteínas

As proteínas podem classificar-se pela forma e pela solubilidade:

• Pela forma as proteínas podem ser fibrosas e globulares. As proteínas fibrosas são insolúveis em água, longas e resistentes, geralmente constituindo estruturas como a alfa‑queratina do pelo e da lã, a fibroína da seda ou o colágeno do tecido conectivo. Em ocasiões também participam de processos contráteis como a miosina e a actina do músculo ou as proteínas dos microtúbulos (tubulina e dineína). As proteínas globulares são solúveis em sistemas aquosos e se dobram sobre si mesmas para dar uma forma esférica. A maioria das proteínas são de tipo globular, incluindo as enzimas, os hormônios proteicos, as proteínas transportadoras, os anticorpos, e as proteínas de membranas e ribossomos. 
• Pela solubilidade as proteínas podem ser: (a) albuminas: solúveis em água e soluções salinas; (b) globulinas: pouco solúveis em água, mas solúveis em soluções salinas; (c) prolaminas: solúveis em soluções de etanol de 70%, mas insolúveis em água, sendo ricas em arginina; (d) histonas: proteínas básicas, solúveis em soluções salinas; e (e) escleroproteínas: insolúveis em água e soluções salinas; são ricas em glicina, alanina e prolina.

Níveis de organização estrutural das proteínas

A organização tridimensional que tomam as proteínas é fundamental para sua atividade, e é dependente das interações que existem entre os resíduos dos aminoácidos; portanto, esta organização depende dos aminoácidos que conformam as proteínas e de como esses aminoácidos interagem entre si para dar uma forma determinada (conformação). Uma mudança na conformação geralmente leva à inatividade da proteína. As proteínas com sua conformação funcional (isto é, aquela conformação necessária para sua atividade biológica) denominam-se proteínas nativas. Existem 4 níveis de estruturação das proteínas:

1) Estrutura primária: diz respeito ao número, tipo e sequência dos aminoácidos que conformam a proteína, bem como à localização das ligações dissulfeto e à ligações intra e intercatenárias, as quais podem ser ligações não covalentes: pontes de H, interações iônicas, interações hidrofóbicas e interações de Van Der Waals. A estabilidade de uma proteína está definida pela soma da energia livre de formação das ligações; apesar das ligações covalentes terem maior variação de energia livre de formação (▲G de -200 a -460 kJ/mol) do que as ligações não covalentes (▲G de -4 a -30 kJ/mol) e serem, portanto, mais fortes, a estabilidade estrutural da proteína está determinada pelas ligações fracas formadas entre os resíduos dos aminoácidos, devido a que estas acontecem em grande número. Em geral, os resíduos hidrofóbicos localizam-se do lado interior da proteína, enquanto que os resíduos hidrofílicos estão no exterior em contato com a água.

2) Estrutura secundária: é a relação estérica (distribuição no espaço) que têm os aminoácidos entre si; podem ser em forma muito ordenada, como na queratina, orientados em uma espiral em forma de hélice ao longo de um eixo (chamada estrutura alfa-hélice). Estas estruturas são muito estáveis e rígidas, mantidas por pontes de H. A formação da estrutura de alfa-hélice é desfavorecida pelos seguintes eventos: repulsão (ou atração) eletrostática entre resíduos de aminoácidos carregados, resíduos de aminoácidos volumosos e presença de prolina. As proteínas também podem estar ordenadas em forma de folha pregada (conformação beta) a qual é uma estrutura mais estendida do que a estrutura alfa‑hélice, tal como é observada na fibroína da seda (também chamada beta-queratina) organizada em forma de zigue-zague e não em forma de hélice, também mantida por pontes de H. Outra forma de organização é a conformação chamada duplaz beta, que consiste em um duplaz (giro) de 180° da cadeia envolvendo a aminoácidos ligados a um extremo de uma cadeia de folha pregada beta. As três formas de estrutura secundária podem coexistir na mesma proteína e são igualmente importantes na função da macromolécula.

3) Estrutura terciária: é consequência direta da estrutura secundária e corresponde à relação estérica total da proteína, ou seja, estabelecendo as regiões ou domínios da molécula. Dependendo da proporção de formas estruturais secundárias, as proteínas podem dar estruturas terciárias correspondentes a proteínas fibrosas ou globulares. Mediante estudos de difração de raios X pode-se determinar para as proteínas globulares, a proporção de alfa-hélice e de conformação beta, bem como o número e a posição de duplazes beta, e inclusive a proporção de regiões dobradas irregularmente ou a proporção de segmentos estendidos. Na conformação da estrutura terciária das proteínas também influi a classe de resíduos dos aminoácidos, os quais organizam-se em função de sua polaridade: hidrofílicos na superfície externa da proteína, hidrofóbicos no interior da proteína e os de polaridade intermediária, a ambos os lados da proteína.

4) Estrutura quaternária:  esta estrutura é exclusiva das proteínas oligoméricas, ou seja, aquelas que possuem mais de uma cadeia unidas por ligações covalentes (ex.: a hemoglobina que tem 4 protômeros). Os protômeros se interrelacionam principalmente mediante ligações fracas (não covalentes) ou também por ligações dissulfeto.

Existem algumas proteínas que possuem grupos químicos diferentes a aminoácidos, tais como lipídios, carboidratos ou metais: são as proteínas conjugadas e seu grupo não peptídico chama-se grupo prostético. As proteínas conjugadas podem ser: lipoproteínas (que contêm lipídios), glicoproteínas (que contêm carboidratos), metaloproteínas (que contêm metais, como Fe, Zn, Ca, Mo, Cu), fosfoproteínas (que contêm fosfatos), hemoproteínas (que contêm o grupo heme), ou flavoproteínas (que contêm nucleotídeos flavínicos).

Solubilidade das proteínas

A solubilidade das proteínas globulares está afetada por vários fatores, como são:

1) Adição de sais: pode aumentar (salting in) ou diminuir (salting out) a solubilidade de uma proteína; no caso do salting out ocorre precipitação da proteína: os íons do sal concorrem com a proteína pelas moléculas de água que as rodeiam, permitindo que as partículas de proteína cheguem perto umas das outras, agrupando-se e precipitando-se; esta técnica é usada para fracionar proteínas em solução devido a que as propriedades de solubilidade variam dependendo de cada proteína

2) Adição de solventes orgânicos: os solventes orgânicos têm baixa constante dielétrica (isto é, têm pouca capacidade para manter duas cargas separadas) permitindo que as moléculas de proteína interajam e precipitem

3) Aquecimento: em forma moderada o calor ajuda a dissolver as proteínas, mas ultrapassando certo limite, o qual varia conforme a proteína, ocorre desnaturação(perda da estrutura terciária)

4) Variação do pH: o pH afeta o grau de dissociação (ionização) dos grupos dissociáveis nos resíduos dos aminoácidos, isto é, o pH afeta a carga das proteínas. O ponto isoelétrico (pI) de uma proteína é o pH no qual a carga neta da proteína é igual a zero; geralmente nesse pH as moléculas da proteína se agrupam e se precipitam, devido a que são afetadas as uniões eletrostáticas que mantêm a estrutura terciária da proteína. As características elétricas das proteínas são uma propriedade que é utilizada para separá-las mediante a técnica de eletroforese. Nesta técnica as proteínas migram num suporte submetido a um campo elétrico, separando-se em função de sua carga e seu peso, tingindo-as depois para serem visualizadas.

As proteínas podem sofrer desnaturação, em ocasiões de forma reversível, devido a altas temperaturas, a pH extremo ou por tratamento com ureia ou com solventes orgânicos (álcool, acetona). A proteína desnaturada perde sua estrutura terciária devido à perda das interações fracas, ou seja, desdobra-se formando uma estrutura aleatória e precipitando-se, embora sem perder sua estrutura primária, isto é, sem ocorrer ruptura das ligações peptídicas, e, portanto, sem perda de suas características nutricionais. Todavia, na desnaturação ocorre perda da ação biológica da proteína, pois esta ação depende da estrutura terciária (proteína nativa).

Catabolismo das proteínas

Os aminoácidos, unidades estruturais das proteínas, podem oxidar-se para contribuir com produção de energia no organismo. As proteínas que se degradam para obter aminoácidos com destino à oxidação podem provir da dieta (proteínas exógenas) ou do próprio organismo (proteínas endógenas). O tipo de alimentação influi marcadamente na origem destas proteínas: os animais carnívoros podem obter 90% dos requerimentos de energia a partir das proteínas da dieta, enquanto que nos herbívoros, somente uma pequena fração das necessidades energéticas são cobertas por proteínas exógenas. Também ocorre degradação oxidativa dos aminoácidos quando há um excesso de ingestão de proteínas na dieta, e para metabolizar parte dos aminoácidos produzidos na proteólise intracelular, a qual ocorre normalmente em todos os tecidos do organismo. A degradação dos aminoácidos inclui sua desaminação. O grupo NH4+ deve ser rapidamente metabolizado devido a sua toxicidade, seja mediante sua incorporação a outros aminoácidos para ser reciclado, seja mediante sua excreção na forma de ureia (nos mamíferos) ou de ácido úrico (nas aves).

Catabolismo dos aminoácidos

Os aminoácidos são degradados por oxidação quando estão em excesso, no caso de dietas com um nível de proteínas que excede às necessidades do organismo, ou em situações onde as necessidades energéticas obrigam a usar aminoácidos como fonte de energia (esgotamento das reservas de glicogênio e de  triglicerídeos), ou no caso de proteólise intracelular. Pouco se conhece sobre esta última; sabe-se que ela se realiza a uma velocidade elevada, o qual está evidenciado pelo constante retorno metabólico (turnover) das proteínas endógenas. As proteínas endógenas podem sofrer hidrólise até aminoácidos, os quais podem ser reciclados para a síntese de nova proteína, ou funcionar como substratos energéticos.

Por outro lado, se o organismo estiver em balanço positivo de proteínas (maior ingresso do que gasto), a proteólise endógena aumenta. Em caso de balanço neutro, a proteólise endógena também ocorre embora a uma taxa bem menor. Nesse caso, se considera que a taxa de retorno metabólico diário das proteínas está por volta de 0,6% do peso corporal (por exemplo, uma vaca de 500 kg degrada 3.000 g de proteína endógena por dia). Vinte e cinco por cento dessa proteína, na forma de aminoácidos, é completamente oxidada para a produção de energia ou é convertida em precursores gliconeogénicos para a formação de glicose. O 75% restante recicla-se para formar nova proteína.

A degradação oxidativa dos aminoácidos se realiza por rotas catabólicas específicas, diferentes para cada um dos 20 aminoácidos proteicos, embora todas as rotas convergem em um dos seguintes metabólitos: piruvato, acetil-CoA, ou compostos intermediários do ciclo do ácido cítrico. Com exceção dos que convergem em acetil-CoA, os aminoácidos constituem substratos precursores da gliconeogênese. O grupo amina dos aminoácidos (NH4+) se excreta em forma de ureia, ácido úrico ou amônia, dependendo da espécie animal. O catabolismo dos aminoácidos tem lugar no fígado, principalmente, e uma menor parte no rim. A primeira etapa da degradação oxidativa dos aminoácidos é a separação do grupo amina, a qual se realiza mediante duas rotas integradas: transaminação e desaminação oxidativa.

Transaminação

As reações de transaminação dos diferentes aminoácidos são realizadas por enzimas específicas chamadas transaminases ou aminotransferases, que utilizam como substrato, além do aminoácido, o alfa-cetoglutarato, transferindo o grupo amina do aminoácido para o carbono a do alfa-cetoglutarato, formando o alfa-cetoácido análogo do aminoácido mais glutamato. As aminotransferases requerem como coenzima o piridoxal-fosfato (forma enzimática da vitamina B6), o qual se encontra como grupo prostético das transaminases. Estas enzimas catalisam as reações conhecidas como “reações biomoleculares pingue-pongue”: o primeiro substrato (aminoácido) se une no sítio ativo da enzima e perde seu grupo amina, produzindo-se um alfa-cetoácido. Este grupo é tomado pelo piridoxal-fosfato, o qual se transforma em piridoxamina-fosfato. Logo depois entra o segundo substrato (o alfa-cetoglutarato), o qual aceita o grupo amina da piridoxamina, convertendo-se em glutamato. Devido a estas reações, os grupos amina dos diferentes aminoácidos são coletados em um único aminoácido: o glutamato. As reações de transaminação são termodinamicamente reversíveis (▲Go‘ = 0 kJ/mol).

Desaminação oxidativa

Mediante a desaminação oxidativa, o glutamato que recolhe os grupos amina de vários aminoácidos nas reações de transaminação, é oxidado e desaminado, por ação da enzima glutamato desidrogenase, numa reação que acontece na mitocôndria dos hepatócitos:

A glutamato desidrogenase é uma enzima alostérica (peso molecular 330 kd) que tem 6 subunidades idênticas, sendo estimulada por ADP, GDP e alguns aminoácidos e inibida por ATP, GTP e NADH. Requer de NAD+ (ou NADP+) como receptor dos elétrons. A ação combinada das transaminases e a glutamato desidrogenase conhece-se como “transdeaminação”.

Quando a célula está precisando de energia (maior relação ADP/ATP) a ação da glutamato desidrogenase aumenta para fornecer alfa-cetoglutarato no ciclo do ácido cítrico. Quando há suficiente energia, o GTP produzido no ciclo de Krebs inibe a glutamato desidrogenase. A NH4+ formada pode ser reutilizada para a síntese de novos aminoácidos ou bem, ser excretada em forma de ureia, no caso dos vertebrados terrestres (animais ureotélicos), em forma de ácido úrico nos répteis e nas aves (animais uricotélicos) ou em forma de amônia nos peixes (animais amoniotélicos).

O grupo amina de muitos tecidos é transportado para o fígado como glutamina, pela ação da enzima glutamina sintetase, em uma reação que requer de ATP para ativar o glutamato. Na mitocôndria hepática a amônia se libera da glutamina para formar glutamato, mediante a enzima glutaminase:

A glutamina é o principal transportador de NH4+ no sangue, tendo maiores níveis sanguíneos que qualquer outro aminoácido. Sua estrutura, sem as cargas elétricas do glutamato, facilita sua passagem através das membranas. O grupo amina também pode ser transportado desde os tecidos (especialmente desde o músculo) para o fígado, pela alanina, devido à ação da enzima alanina aminotransferase (ALT), a qual atua reversivelmente em ambos os tecidos:

A alanina, sem cargas elétricas em seu resíduo, atravessa facilmente as membranas. A anterior reação serve também para remover o piruvato do músculo, produzido na glicólise. O piruvato pode ser levado para o fígado onde serve de precursor de glicose via gliconeogênese. A glicose pode voltar para o músculo para servir de fonte de energia (“ciclo glicose-alanina”).

Ciclo da ureia

Os animais ureotélicos sintetizam ureia a partir do grupo amina liberado pelos aminoácidos, mediante uma série de reações conhecidas como o ciclo da ureia, via descoberta por Krebs e Henseleit, em 1932, antes de ser elucidado o ciclo do ácido cítrico. Neste processo, que se realiza no fígado, incorporam-se dois grupos amina e um CO2 na molécula de ureia. As duas primeiras reações do ciclo ocorrem na mitocôndria do hepatócito e as restantes no citosol. As reações do ciclo da ureia são as seguintes:

1) Condensação de NH4+ e CO2: síntese de carbamoil-fosfato

O CO2, produzido na respiração celular, e a amônia se condensam mediante a enzima carbamoil-fosfato sintetase-I, reação que é altamente endergônica, requerendo de 2 ATP (a forma II da enzima está no citosol):

A carbamoil-fosfato sintetase é uma enzima regulatória que tem como modulador estimulatório o N-acetilglutamato, composto produzido a partir de acetil-CoA e glutamato pela enzima N-acetilglutamato sintetase:

A enzima N-acetilglutamato sintetase, por sua vez, é estimulada pela arginina, composto intermediário do ciclo da ureia, e que se acumula quando o ciclo se torna mais lento. Assim, a arginina estimula a formação de N-acetilglutamato, o qual estimula a ação da carbamoil-fosfato sintetase, para aumentar a velocidade do ciclo.

2) Formação de citrulina:

O aminoácido ornitina entra na mitocôndria para se condensar com o grupo carbamoil-fosfato e render citrulina, graças à enzima ornit­ina-carbamoil transferase, reação facilitada pela hidrólise do grupo fosfato do carbamoil-fosfato:

ornitina + carbamoil-fosfato →  citrulina + Pi

Até aqui as reações acontecem na mitocôndria. Na sequência, a citrulina abandona a mitocôndria para continuar o ciclo no citosol.

3) Condensação do aspartato com a citrulina:

O aminoácido aspartato (o qual introduz outro grupo amina no ciclo) se condensa com a citrulina numa reação que consume energia, e que é catalisada pela enzima arginino-succinato sintetase:

citrulina + aspartato + ATP  →  arginino-succinato + AMP + PPi

O AMP produzido na anterior reação deve ser convertido em ADP mediante a participação de um ATP, o que significa que na reação gastam-se realmente dois ATP.

4) Escisão do arginino-succinato:

Esta quebra, mediante a enzima arginino-succinato liase, origina fumarato, o qual ingressa à mitocôndria como intermediário do ciclo do ácido cítrico, mais o aminoácido arginina:

arginino-succinato →   fumarato + arginina

5) Hidrólise da arginina e formação de ureia:

Reação catalisada pela arginase, a qual tem como cofator o Mn2+, para dar ureia e repor a ornitina, fechando o ciclo:

arginina + H2O →   ornitina + ureia

A ornitina volta à mitocôndria para reiniciar um novo ciclo, e a ureia pode ir para o rim via sanguínea para ser excretada pela urina. A reação global do ciclo da ureia pode se escrever assim:

A formação de ureia é um processo endergônico, de alto custo energético, no qual são gastos 4 ATP: dois para formar o carbamoil-fosfato, um para formar o arginino-succinato e mais um para transformar o AMP, que se produz na formação do arginino-succinato, em ADP.

Nos ruminantes, os níveis sanguíneos de ureia são elevados (23-58 mg/dL) devido à absorção de amônia pelo rúmen. Nesses animais, a amônia deve metabolizar-se no fígado para dar ureia, a qual se recicla voltando ao rúmen via sanguínea ou via salivar, o que significa uma poupança da energia necessária para a formação de ureia e de água para sua própria excreção. Nos animais carnívoros a concentração de ureia é da ordem de 40 mg/dL.

A compartimentação na mitocôndria das primeiras duas reações do ciclo da ureia impede a saída para o sangue do íon amônia, o qual é altamente tóxico. Essa toxicidade se deve a que a amônia pode se incorporar no alfa-cetoglutarato, composto intermediário do ciclo do ácido cítrico, para dar glutamato, mediante a enzima glutamato desidrogenase. Um elevado nível de NH4+ pode extrair demasiado alfa-cetoglutarato e, eventualmente, deter o ciclo do ácido cítrico e a cadeia respiratória, sendo especialmente sensível o tecido cerebral. Por outro lado, a forma protonada da amônia se dissocia tendo um pK de 9.5:

NH4+ –> NH3 + H+

A pH 7,0 a maioria da amônia se encontra na forma protonada (NH4+). Entretanto, diante de um excesso de NH4+, uma parte resulta em NH3 provocando certa alcalinidade nos tecidos e causando falhas no metabolismo celular. Nos peixes, a amônia se incorpora no glutamato para formar glutamina, a qual pode voltar a desaminar-se no rim e liberar a amônia diretamente pela urina:

no fígado:

glutamato + NH4+ + ATP –> glutamina + ADP + Pi

no rim:

glutamina –> glutamato + NH4+

A amônia no sangue dos peixes também pode ser eliminada diretamente na água, pelas brânquias. A excreção da amônia na forma de ureia é dependente de uma grande disponibilidade de água no organismo. Nas aves, cujo peso corporal total tem pouca proporção de água, a fim de permitir o voo, bem como nos répteis, que vivem geralmente sob ambientes áridos, a amônia se excreta na forma de ácido úrico, uma purina que é intermediária no catabolismo dos nucleotídeos.

Vias catabólicas dos esqueletos carbonados dos aminoácidos

O catabolismo dos aminoácidos não é uma via tão ativa quanto a glicólise ou a oxidação dos ácidos graxos. As rotas catabólicas dos aminoácidos variam em sua atividade dependendo das necessidades energéticas ou biossintéticas do organismo. Existem 20 vias catabólicas, uma para cada um dos 20 aminoácidos proteicos, que convergem em 5 possíveis produtos finais, os quais podem ingressar no ciclo do ácido cítrico para seguir a oxidação total até CO2 e H2O, ou para sair como precursores da gliconeogênese, dependendo do estado metabólico do organismo. Dez aminoácidos podem terminar em acetil-CoA, 5 terminam em alfa-cetoglutarato, 4 em succinato, 2 em fumarato e 2 em oxalacetato; contudo vários desses aminoácidos podem ter outras rotas.

Via acetil‑CoA

Dez aminoácidos podem terminar em acetil-CoA, para entrar no ciclo do ácido cítrico: 5 deles via piruvato e os restantes 5 podem dar acetoacetil-CoA, o qual se rompe para dar duas moléculas de acetil-CoA. Os aminoácidos que geram piruvato são alanina, glicina, serina, cisteína e triptofano. Os aminoácidos triptofano, lisina, fenilalanina, tirosina, leucina e isoleucina produzem acetil-CoA e/ou acetoacetil-CoA. Estes últimos aminoácidos são chamados de “cetogênicos”, embora fenilalanina e tirosina também podem produzir fumarato, triptofano pode também formar piruvato e isoleucina pode formar succinil-CoA via propionil-CoA. A leucina é o único aminoácido rigorosamente cetogénico, isto é, só pode terminar em acetil-CoA. Em humanos existe uma falha genética relacionada com o catabolismo da fenilalanina: uma deficiência na síntese da enzima fenilalanina hidroxilase, a qual converte a fenilalanina em tirosina:

fenilalanina + O2 + NADH + H+

↓

tirosina + NAD+ + H2O

A enzima é uma oxidase que utiliza o O2 diretamente para oxidar a fenilalanina: um oxigênio se incorpora como grupo hidroxila (-OH) para formar tirosina e o outro oxigênio se reduz para dar H2O, utilizando NADH. A enzima requer como cofator da tetra-hidrobiopterina, que funciona como transportador dos elétrons desde o NADH até o O2. A deficiência da fenilalanina hidroxilase se conhece como fenilcetonúria, e consiste na acumulação de fenilalanina a qual não se pode metabolizar normalmente. A fenilalanina toma uma via secundária na qual ocorre transaminação com o piruvato, e formação de fenilpiruvato, metabólito que é descarboxilado para produzir fenilacetato, corpo cetônico que dá um cheiro característico na urina. A fenilcetonúria apresenta-se em 8 de cada 100.000 indivíduos e pode causar severo retardo mental, se não for tratada no recém-nascido.

Via a‑cetoglutarato

Os aminoácidos arginina, histidina, glutamato, glutamina e prolina são degradados via alfa-cetoglutarato e entram diretamente no ciclo do ácido cítrico. As vias catabólicas de todos esses aminoácidos terminam em glutamato, o qual é desaminado e oxidado para dar alfa-cetoglutarato, mediante a enzima glutamato desidrogenase:

glutamato + NADP+

↓

alfa-cetoglutarato + NADPH + H+ + NH4+

Via succinil‑CoA

Os aminoácidos que são catabolizados via succinato são metionina, isoleucina, treonina e valina. Isoleucina também pode dar acetil-CoA. Por esta via os aminoácidos são convertidos em propionil-CoA, e a partir deste em succinil-CoA, mediante as mesmas reações da gliconeogênese que tem como precursor o propionato. Estas reações são de vital importância nos ruminantes, os quais dependem desta rota para converter o propionato de origem ruminal em glicose, via succinil-CoA. Uma enzima desta rota, a metilmalonil-CoA mutase é dependente da coenzima B12.

Via oxalacetato

Somente dois aminoácidos, aspartato e asparagina, são catabolizados via oxalacetato (OAA) para entrar no ciclo do ácido cítrico. A asparagina é desaminada pela enzima asparaginase para dar aspartato:

asparagina + H2O → aspartato + NH4+

Depois, o aspartato sofre transaminação com alfa‑cetoglutarato para dar OAA, mediante a enzima aspartato aminotransferase (AST):

alfa-cetoglutarato + aspartato → OAA + glutamato

Os aminoácidos que formam piruvato ou metabólitos intermediários do ciclo do ácido cítrico, podem formar glicose via gluconeogênese e são chamados de “gliconeogénicos”. Quatro aminoácidos podem ser gliconeogénicos ou cetogénicos, dependendo da rota que sigam: triptofano, fenilalanina, tirosina e isoleucina.